从肾脏到尿道的尿路梗阻是婴儿肾损伤的重要原因。长期梗阻可能发展为严重的肾脏炎症、纤维化和慢性肾病。尿路梗阻导致肾内皮素（ET）1 水平升高，提示肾脏 ET1 可能导致梗阻性肾病。ET有三种不同的异构体（ET1、ET2和ET3）。血管活性 ET 异构体是由 ET 转化酶（ECE）诱导的前分子大 ET 蛋白水解加工为生物活性肽产生的。ECE1 主要在肾小管区域表达。H2O2是一种活性氧（ROS）配资炒股网站专业必选，可反式激活 ECE1 的启动子并增加其水平。尿路梗阻导致显著的 ROS 生成和肾小管细胞的伸展。研究还表明，机械拉伸是细胞氧化还原信号传导的有效驱动因素，但肾小管细胞拉伸是否刺激 ROS 和下游 ET 的产生尚未明确。
ET 同源受体（ETR）与 G 蛋白偶联，它们的刺激导致平滑肌细胞（SMC）离子通道激活并随之控制细胞内 Ca2+（[Ca2+]i）水平和血管反应性。ET1 通过激活平滑肌细胞TRPC3 收缩脑动脉，但血管调节的基础机制存在区域异质性。研究表明，TRPC3 介导新生猪肾微血管 SMC 中的受体操纵的钙内流（ROCE）。然而，尽管对其他血管床进行了大量工作，但肾微血管 SMC 中 TRP 通道的病理生理学知之甚少。
啮齿类动物梗阻性肾病的治疗尚未转化为人类的成功临床结果。因此，需要新的途径和动物模型来确定梗阻性急性肾损伤（AKI）的早期机制和新的治疗靶点，以防止婴儿肾损失。然而，由于人类和猪的肾脏系统在解剖和功能上相似，猪模型可能比啮齿动物更能模拟人类梗阻性肾病的病理生理学。机械拉伸培养的肾上皮细胞是单侧输尿管梗阻（UUO）诱导的肾小管应激的体外模型。
展开剩余84%基于此，美国田纳西大学健康科学中心医学院生理学系团队在一项研究中使用了新生猪肾上皮细胞系和短期 UUO 模型，以验证拉伸驱动的 ROS 刺激新生儿肾脏中 ET 产生，导致下游肾脏血管收缩的假设。研究成果发表于 Redox Biology 期刊题为“Induction of reactive oxygen species by mechanical stretch drives endothelin production in neonatal pig renal epithelial cells”。
ECE1 和 ET1 异构体主要在猪肾细胞系 LLC-PK1 细胞和整个新生猪肾脏中表达。为了调查 H2O2是否刺激 LLC-PK1 细胞中 ECE1 的产生，使用葡萄糖氧化酶（GOD）持续生成H2O2。结果发现，GOD 处理后细胞 H2O2 产生和ECE1 水平增加，GOD 还增加了细胞中ET1-3 水平和 panET 免疫染色。这说明，H2O2诱导 LLC-PK1 细胞产生 ECE1-依赖性 ET1-3。
如 f-肌动蛋白免疫染色所示，10% 循环单轴机械拉伸的 LLC-PK1 细胞比未拉伸的细胞更长（图1 A）。qRT-PCR 显示，在拉伸的 LLC-PK1 细胞中，NOX2 和 NOX4 mRNAs 分别增加了 4 倍和 2 倍（图1 B、C）。拉伸后的细胞显示过氧化氢酶免疫染色显著降低，细胞 H2O2 增加（图1 D-F）。拉伸诱导的细胞 H2O2 和ECE1 增加被 EUK（一种超氧化物歧化酶和过氧化氢酶模拟物）逆转（图1 F、G）。拉伸细胞中的 ET1-3 水平也增加，而 EUK 和 ECE1 抑制剂 CGS 使其减弱（图1 H-J）。NOX 抑制剂 apocynin 也减少了拉伸诱导的 ECE1 和 ET1-3 的产生。此外，siRNA 介导的 NOX2 和 NOX4 敲低同样减弱了拉伸诱导的 ECE1 和 ET1-3。这些数据表明，机械拉伸在 LLC-PK1 细胞中产生 H2O2并诱导 ECE1-依赖性 ET1-3 产生。
图1 机械拉伸在 LLC-PK1 细胞中产生 H2O2并诱导 ECE1-依赖性 ET1-3 产生。
阻塞左输尿管 3 小时后恢复 3 小时，未导致新生猪出现明显的形态性肾损伤。然而，急性可逆性 UUO（rUUO）增加了猪尿异前列腺素（肾氧化应激标志物）和 H2O2水平，但降低过氧化氢酶的免疫染色。IHC 显示，ECE1 在肾小管中表达，其被 rUUO 扩增。 rUUO 后 mRNA 表达、肾组织中的酶活性和尿液 ECE1 的水平高于对照组。rUUO 猪的肾小管免疫染色和 ET1-3 水平升高，而CGS 逆转了这一点。这说明，急性可逆性 UUO 刺激新生猪肾脏中 H2O2产生和 ECE1-依赖性 ET1-3 产生。
在没有细胞外 Ca2+ 的情况下，ET 没有增加新生猪入球小动脉中 [Ca2+]i 水平（图2 A、B）。细胞外 Ca2+ 的恢复导致 ET 诱导的 [Ca2+]i 增加约150 nM（图2 A、B）。ROCE 激活剂 DAG 类似物 OAG 显著升高微血管中的 [Ca2+]i，选择性 TRPC3 阻断剂 Pyr3 则减弱 [Ca2+]i（图2 C、D）。尽管尼莫地平阻断L-型电压门控式Ca2+ 通道（L-VGCC），他普西加金耗竭细胞内 Ca2+ 贮存，但激活 ETR还是能够提高 [Ca2+]i水平（图2 E、F）。虽然选择性 TRPC6 通道阻滞剂 SAR 7334 没有效果，但 Pyr3 基本上消除了 ET1 诱导的 ROCE。将 ET1-3 直接输注到肾脏中以尽量减少其全身影响，导致肾皮质灌注和总肾血流量（tRBF）减少，肾血管阻力（RVR）增加，而这些被 Pyr3 减弱。这些数据表明，ET 受体（ETR）的激活触发了入球小动脉平滑肌细胞中受体操控式Ca2+ 内流（ROCE），并通过 TRPC3 通道导致肾脏灌注不足。
图2 ET 受体（ETR）的激活触发了入球小动脉平滑肌细胞中ROCE。
此外，结果显示，假手术猪的 tRBF 和 RVR 保持不变。相比之下，在 UUO 期间，tRBF 降低，RVR 增加，并且尽管去除了阻塞，但仍未恢复。用 CGS、ETR 拮抗剂波生坦和 pyr3 处理则逆转了 rUUO 诱导的 tRBF 降低和 RVR 增加。这说明，rUUO 通过激活 ECE1/ETR/TRPC3引起肾脏灌注不足。
从新生猪肾微血管中分离的蛋白，用抗-ETRA、ETRB和TRPC3抗体进行Western blot检测，结果显示急性rUUO猪体内这些蛋白的表达没有改变（图3 A-C）。rUUO 增加了尿液早期 AKI 生物标志物 NGAL、L-FABP 和 IL-18 的水平（图3 D-F）。rUUO 诱导的这些生物标志物的增加被 CGS、波生坦和 Pyr3 逆转（图3 D-F）。这些数据表明，rUUO 未改变 ETR和 TRPC3 的蛋白表达水平，但通过激活 ECE1/ETR/TRPC3 信号诱导早期 AKI。
图3 rUUO未改变 ETR和 TRPC3 的蛋白表达水平，但通过激活ECE1/ETR/TRPC3 信号诱导早期 AKI
图4 机械拉伸：诱导新生猪微循环损伤与早期肾衰的多重机制
尽管先前的研究表明，新生儿尿路梗阻会增加肾脏 ET1 水平，但对梗阻肾脏中的拉伸应力-ET 分子的联系知之甚少。这项研究提供了新的数据，表明拉伸驱动的氧自由基刺激新生猪肾上皮细胞中所有 ET 异构体的产生。ET 激活肾血管 SMC TRPC3，导致持续性血管收缩和 RVR 增加。这些机制可能导致尿路梗阻引起的新生儿 AKI 的早期血管变化。
参考文献：Kumar R, Soni H, Afolabi JM, Kanthakumar P, Mankuzhy PD, Iwhiwhu SA, Adebiyi A. Induction of reactive oxygen species by mechanical stretch drives endothelin production in neonatal pig renal epithelial cells. Redox Biol. 2022 Sep;55:102394. doi: 10.1016/j.redox.2022.102394. Epub 2022 Jul 4. PMID: 35841629; PMCID: PMC9289874.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35841629/
Impact Factor 10.7
Online ISSN: 2213-2317
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发布于：上海市